Why Johnny can't clone: Common pitfalls and not so common solutions

摘要：

克隆基因的需求在过去32年间不停地增长，但是对于那些需要重组质粒的人而言，他们仍在挣扎着做出它们。尽管传统的基于连接的克隆的陷阱并不会带来多大问题，但是其实只要足够注意，大多数的陷阱都是可以避免的。在这里，我们回顾了用于克隆基因到质粒的酶和试剂的化学性质，从而讨论到与此相关的诸多细节。值得指出的是，琼脂糖凝胶电泳的检测，DNA和二氧化硅之间相互作用的原理以及热稳定DNA聚合酶的问题，限制性内切酶和T4 DNA连接酶的效果在这里进行深入探讨。全面认识已经建立的方法，对于解决在调整技术时产生的问题，根据需求执行替代和创造新方案而言，是非常重要的。

介绍：

将DNA整合到载体中然后将重组产物转化到微生物中（分子克隆）似乎看起来很简单明了。将DNA片段克隆进入细菌质粒首次报道于1973年，然而克隆PCR产物却直到1986年才被首次报道。持续改善的技术，不断发展的替代方案，商业化克隆试剂盒以及出现的特殊的合作研究机构（项目外包）已经给哪些想要做分子克隆实验的研究者提供了一个非常广的选择。在某种程度上说，对于那些并不参与实际工作的人来说，质粒构建已经商品化了。

分子克隆中的技术障碍并非都是不重要的，但是发展解决他们的理论知识和为了解决他们而做出努力这样的事却被忽略。新手常常并不太了解情况也不能绕开陷阱，我们可以看到许多新手很羞愧自己做不出来结果，又或者费了极大力气克隆基因和建立文库。如果一种方法不能产生想要的构建产物，研究人员常常采取的方法是，重复试验。而这样做的话，要么是同样不幸的没有做出结果，要么就是使用能起到很小帮助的试错法。前面提到的不断涌生的克隆方法和试剂盒至少在某种程度来说是由跟可靠性相关的问题驱动的。产生了过多的备选方案也是一个麻烦，因为它会令科学家们感到困惑。为什么会困惑呢?因为每个开发者都会争论，而且是毫无理由的争论说，他们的方法更快，更方便，更有效（至少在最优条件下是这样），还有比其他方法便宜。做研究的成本，尤其是高收入国家里的劳动力的成本，是远远比分子克隆实验中消耗的试剂所产生的边际可变成本高的。所以，实验老是失败和重复，将会令实验成本大大提高。因此，最有效改进克隆效率的方法就是使用那些，易于理解、监控以及查错的技术，这样一来，重复的次数就会最小化。

克隆实验是由那些，并不会为了分子生物学而进化的酶，所介导的。他们在体内的活动，借由经典生物化学的框架是非常容易理解的。在这里，我回顾了，用于克隆DNA片段、PCR产物的酶、基质和试剂的催化性质和生物物理性质。然后将这些性质跟常见的分子生物学技术，像DNA纯化和分离，联系起来。最近的综述都偏向于更新的克隆技术，所以这很容易使学生荒谬的认为，已经建立的技术已经不能很好的工作了。每个反应，包括想要的和令人担心的，在某种程度上说，是特殊的浓度和微观上的常数的函数。他们会照着这种关系来发生演变。因为如此，对这些反应的机制的理解是非常关键的。无论是对于现存方法的优化或者开发新技术都离不开它。



“Awesome” agarose - 了不起的琼脂糖

PCR产物传统方法是，使用引物与独特的酶切位点合作实现。内切酶被用来在PCR产物和受体质粒上产生黏性末端。酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳分离；目的切割片段接着从胶上回收。两个DNA片段用T4DNA连接酶催化连接。然后连接产物被转化到大肠杆菌中，最后，转化子通过质粒上的抗生素抗性标记筛选得到。这种传统方法属于劳动密集型，几乎每一步的陷阱都被很好的认识到了，除了DNA的纯化以及PCR产物末端的结构异质性，通过琼脂糖凝胶电泳可以很好的监控这一切（Figure 1）。由此我们认为，质粒以及PCR产物应当在传化之前和之后、酶切后、胶纯化后以及连接后进行验证，这样在进行下一步前，对每一步都进行确认。微量紫外光谱仪近些年变得十分流行，但是这些设备并不是设计来区分基质和DNA修饰产物的。琼脂糖凝胶电泳使得我们可以在问题出现时立刻发现他们；有经验的基因工程人员能够通过解决这些问题节约大量时间而不是不断地修补以及重新开始。

琼脂糖凝胶电泳的替代物已经被设计出来了，但是还没十分普及。在我的实验室里，“mini-gels”使我们用来分辨小片段（<5 kb）的方法，因为这非常方便，快速，并且(相比于大胶来说)更加敏感，试剂费用更低（琼脂糖，染料，以及电泳的缓冲液，详见附件）。倒在75x52的玻璃板上的Mini-gels能够大量生产然后保存（Figure 2）。更短和更薄的胶能够更快地被电泳，相比于那些更厚的来说，也不用进行过度加热。（小的胶盒中只需5v / cm,就像Owl C2-S）。分辨率（条带的物理分离）效果不如大胶好（Figure
3），但是对于日常克隆实验中的小片段来说，足够了。我们使用地摩尔浓度的电泳介质（10mM 硼酸锂，pH 8.2）进行小条带(<2 kb)的快速分辨；我们使用更高导电性的TAE缓冲液（40mM Tris, 20mM 的乙酸，1mM的EDTA）对更大的条带进行电泳，因为使用低摩尔浓度(5 mM 硼酸锂，pH 7.2)的mini-gels无法胜任。任何使得克隆人员能够跑更多胶的创新都是对质量控制标准的持续促进。





[我的补充：Owl™ C2-S：http://www.thermoscientific.com/content/tfs/en/product/owl-c2-s-micro-electrophoresis-system.html

Owl™ C2-S Micro Electrophoresis System

Screen up to seven samples on one gel in less than five minutes with this product!





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"Stick-less" silica - 不怎么黏的二氧化硅

DNA纯化（将质粒从核酸、细菌细胞提取物污染物中分离出来；将PCR产物从引物、模板和聚合酶中分离出来；将酶切片段从其他片段和琼脂糖中分离出来）能够使得一个克隆项目因此而成功或者失败。接下来的任何酶催化反应都能从DNA基底的浓度和抑制物上预测到结果，也包括不想要的DNA。大多数分子生物学家现在依赖于基于二氧化硅的DNA纯化试剂盒，或者是稍微低效些的离子交换树脂，而不是过去常用的苯酚\氯仿抽提，酒精沉淀然后进行氯化铯梯度离心。阴离子交换层析很耗时，所以现在只在那些对于从细胞提取物分离质粒纯度要求很高的实验中用到，比如哺乳细胞转染。硅胶模离心吸附柱相对来说不贵、方便（用完即仍）并且通用，因为他们能够被用于质粒的准备、PCR产物纯化或者从硅胶中分离回收酶切片段。

从琼脂糖凝胶中纯化DNA是一个值得在此处进行探讨的问题，因为，分离得到目的酶切片段能够防止生成不想要的连接产物。然而，将条带从胶上切下来在技术上是不可回避的操作，因此无法实现自动化。此外，将DNA暴露在紫外线下，会急剧地减少转化活性，尽管向缓冲液中加入鸟苷可以提供有效地保护。目前的胶纯化技术的纯化产量不太高，所以大多数克隆人员消化微克级DNA（亿万的双链DNA分子）来生成一个最终的重组分子。胶纯化的好处（包括提高克隆效率、减少非预期的连接
4000
产物）比之前提到的缺点和陷阱更加重要，所以每个克隆专家至少掌握了一种琼脂糖凝胶提取技术。

并非所有研究人员都使用同一种胶纯化技术，由此说明没有一种是绝对可靠的。在我们实验室，我们使用硅胶模离心吸附柱来从琼脂糖凝胶中纯化酶切的DNA但跟商品化方法（下面会提到）不同，一次来最大化产量和纯度。其他普遍使用的胶纯化方法包括电洗脱技术（从胶块上或者将条带跑进第二个孔），使用阴离子交换纸来吸附和洗脱（Whatman DE81 or Schleicher and Schuell NA-45），苯酚/氯仿法从低熔点琼脂糖中提取，冷冻挤压和琼脂水解酶消化法。大多数研究人员会使用硅胶模离心吸附柱来做胶提取并不是因为这种方法能够有最好的回收率或者纯度而是因为这种方法更容易。琼脂残留物或者各种在胶回收过程中引入的溶剂和盐可能会抑制T4
DNA连接酶活性，然后进一步影响克隆效率。这些物质很难检测，所以他们一般被忽略了，知道后来琼脂糖凝胶电泳使得连接效率提升了以后才使人们开始关注这个问题。

（待续）

参考文献：

Matsumura, I. Why johnny can't clone: Common pitfalls and notso common solutions.BioTechniques2015,59, IV-XIII.