文库的构建及测序(未完待续)
2015-10-06 22:11
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提取样品总 RNA后,用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物 mRNA(若为原核生物,则用试剂盒去除 rRNA后进入下一步)。加入 fragmentation buffer将mRNA打断成短片段,以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链,然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I合成第二条cDNA链,在经过 QiaQuick PCR 试剂盒纯化并加 EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly(A)并连接测序接头,然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择,最后进行PCR
扩增,建好的测序文库 (200 bp) 用Illumina HiSeq™ 2000进行测序。
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